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百思不得其解之“色譜雙峰”
發(fā)布時(shí)間：2019.07.05 閱讀量：2023
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰：未出峰、幾個(gè)峰是負(fù)峰、出現(xiàn)雙峰或肩峰、前伸峰、拖尾峰、平頭峰、鬼峰等，要區(qū)別對(duì)待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。
在HPLC分析中，色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳。但是，在對(duì)樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理時(shí)，會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對(duì)色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對(duì)于新手更是如此。比如說色譜雙峰的問題，這種情況大致可分為四種原因：
1 .色譜柱
如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題－保護(hù)柱污染或柱頭固定相變臟或流失，或顆粒聚集在色譜柱的入口篩板上。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。
2 .溶劑極性及進(jìn)樣量
許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的hplc的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前hplc分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前(相對(duì)進(jìn)樣量少而言)，將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！＿@是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。這是上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對(duì)量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。如果樣品溶劑與流動(dòng)相不溶或互溶性不好，當(dāng)樣品注入色譜分離體系中，會(huì)析出并接著再溶解的可能，這時(shí)相當(dāng)于二次進(jìn)樣，也非常容易產(chǎn)生雙峰。
3 .樣品的特性及pH值
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，甚至三峰.這時(shí)一般雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯.pH對(duì)峰形的影響在緩沖液流動(dòng)相平衡過程中非常明顯，當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)，受pH的連續(xù)變化影響會(huì)經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。另外，在樣品分析時(shí)，流動(dòng)相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點(diǎn)，否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對(duì)試劑分析時(shí)，選擇不好條件也會(huì)容易引起雙峰的產(chǎn)生。
4 .儀器參數(shù)
記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。還有一種情況是，參比波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤，例如設(shè)置分析波長(zhǎng)254nm，參比波長(zhǎng)400nm，這個(gè)對(duì)于大多數(shù)化合物可能沒影響。但是如果被測(cè)化合物，在400nm處也有強(qiáng)的紫外吸收，比254nm更高。這樣其出峰時(shí)，由于背景的抵扣作用，本來一個(gè)峰會(huì)變成對(duì)稱的二個(gè)峰，而且如果將二峰之間的峰谷反轉(zhuǎn)180度，恰好是一個(gè)完整的峰。這時(shí)要將參比波長(zhǎng)設(shè)置更大，或者取消。
HPLC （高效液相色譜法）技術(shù)發(fā)展至今，其應(yīng)用范圍已經(jīng)涉及到多個(gè)領(lǐng)域：
1.環(huán)境分析中的應(yīng)用：可應(yīng)用于環(huán)芳烴、農(nóng)藥 殘留分析等。
2.食品分析中的應(yīng)用：可應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)成分分析、食品添加劑分析、食品污染物分析等。
3.生命科學(xué)中的應(yīng)用：可在分子水平上研究生命科學(xué)、遺傳工程、臨床化學(xué)、分子生物學(xué)及生化領(lǐng)域的分子量物質(zhì)純化、分離和測(cè)定等。
4.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用：體液中代謝物測(cè)定、藥代動(dòng)力學(xué)研究、臨床藥物監(jiān)測(cè)等的分析測(cè)定。
5.無機(jī)分析中的應(yīng)用：陰、陽(yáng)離子的分析等。
其最大的特點(diǎn)是可以分離不可揮發(fā)或受熱后不穩(wěn)定的有機(jī)物。且HPLC法色譜柱可以反復(fù)使用，分離效率高，分析速度快，靈敏度高，操作自動(dòng)化，適用范圍廣( 樣品不需氣化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，在《中國(guó)藥典》中該法已成為中藥制劑含量測(cè)定最常用的分析方法。它與氣相色譜法配合使用，幾乎可以承擔(dān)絕大部分的有機(jī)物分離測(cè)試任務(wù)。
HPLC法應(yīng)用如此廣泛，幾乎是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的必備基礎(chǔ)分析儀器，實(shí)驗(yàn)分析員們最多操作的也是高相液相色譜儀，所以遇到問題可能也是最多的，那么，只要多多動(dòng)手，多多思考，多多總結(jié)，日積月累，對(duì)于HPLC法你會(huì)變得更加游刃有余！
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